ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
проблемы. Проблема адаптации животных и человека к низким температурам является
актуальной в связи с все большим проникновением человека в полярные районы
земли и освоением природных ресурсов Севера и Сибири (Мешалкин, Верещагин,
1985).
Искусственная
гипотермия с охлаждением тела до 20-24°С находит применение в хирургии при
операциях на сердце и центральной нервной системы. Она значительно снижает
обмен веществ головного мозга, и, следовательно, уменьшает потребность его в
кислороде. Поэтому мозг в таких условиях способен переносить более длительное
обескровливание (вместо 3-5 минут при нормальной температуре, до 15-20 мин при
25-28°С) (Sakurai et al., 2005).
В
природе существует несколько различных типов гипотермии, наиболее уникальной из
которых является зимняя спячка (Эмирбеков, Львова, 1985). Зимняя спячка - это
эволюционно выработанная способность животных приспосабливаться к низким
температурам среды путем снижения температуры тела, а, следовательно,
метаболизма. У зимоспящих животных температурный диапазон активности биохимических
реакций более широкий (от 0 до 38°С) (Эмирбеков, Львова, 1985; Storey, Storey,
2000; Geiser, 2004).
У
гипотермированных животных, как и у животных, впадающих в зимнюю спячку,
скорость метаболизма снижается по мере снижения температуры (Kataoka, Yanase,
1998). Изменения, вызываемые гипотермией, обнаруживаются во всех изучаемых
органах, но вместе с тем установлено, что различные органы по-разному реагируют
на глубину и скорость охлаждения (Рыжакова, 1997). Выраженность изменений
находится в прямой зависимости от глубины гипотермии (Бернштейн, 1971).
Согласно
теории Хочачка (Hochachka, Somero, 2002) при гипотермии угнетаются процессы
синтеза АТФ, наступает дефицит энергии, что замедляет транспорт Са2+ из
цитозоля в среду. Накапливаясь в цитозоле, Са2+ нарушает метаболизм клетки.
Незначительное (с 10-8 М в норме до 10-6 М) повышение Са2+ в цитозоле приводит
к активации различных протеолитических и липолитических ферментов в клетке,
вследствие чего начинают разрушаться клеточные мембраны (Иванов и др., 1999).
На
протяжении многих лет считалось, что основными протеолитическими ферментами
клеток животных и человека являются катепсины, осуществляющие деградацию белков
в кислой среде. Вместе с тем выявлены протеолитические ферменты с оптимумом
действия в зоне нейтральных значений рН. Среди последних особого внимания
заслуживают тиоловые протеиназы - кальпаины, активность которых в значительной
мере зависит от присутствия в среде ионов Са2+ (Сологуб, Пашковская, 1998).
Ферменты этого семейства участвуют в таких процессах как клеточная миграция,
цитоскелетное ремоделирование, клеточная дифференциация и апоптоз. Активация
кальпаина наблюдается также при таких патологических состояниях как мышечная
дистрофия, сердечная и церебральная ишемия, агрегация эритроцитов, нейродегенеративные
болезни, катаракта и болезнь Альцгеймера (Khorchid, Ikura, 2002).
В
клетках нервной ткани животных и человека имеется, связанная с миелином, Са2+ -
активируемая нейтральная протеаза, которая осуществляет расщепление основного
белка до полипептидов с молекулярной массой 6-17 килодальтон (кД). Так как
основному белку миелина приписывается важное значение в этиологии
множественного склероза и близких ему заболеваний, связанных с демиелинизацией,
то изучение этой протеазы может содействовать расшифровке механизмов
возникновения патологических состояний (Сологуб, Пашковская, 1988).
Зависимость
активности кальпаинов от Са2+ может обеспечивать функционирование регуляторного
механизма за счет изменения в клетках уровня катиона и участия Са2+ - активируемых
нейтральных протеаз в ограниченном протеолизе, что в свою очередь ведет к
изменению соотношения активности ряда ферментов (Moldoveanu et al., 2002). Не
исключено, что образуемые в этом процессе фрагменты белковых молекул в свою
очередь могут служить вторичными мессенджерами и оказывать активирующее или
ингибирующее влияние на геном и клеточные ферменты (Kenyon et al., 2003).
В
связи с этим, сравнительное изучение активности нейтральных протеаз в различных
тканях гетеротермов в динамике зимней спячки, и гомойотермов при гипотермии,
представляет значительный интерес.
Цели
и задачи исследования. Целью нашей работы явилось сравнительное исследование
активности нейтральных протеаз в тканях гомойо- и гетеротермных животных в
условиях искусственной и естественной гипотермии.
Для
достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать
общую активность нейтральных протеаз в мозгу, печени и сердечной мышце в
динамике зимней спячки сусликов.
Исследовать
общую активность нейтральных протеаз в мозгу, печени и сердечной мышце при 2-х
месячной зимней спячки сусликов и в ходе их индуцированного пробуждения.
Исследовать
общую активность нейтральных протеаз в мозгу, печени, сердечной мышце и
сыворотке крови крыс при гипотермии разной глубины и длительности.
Исследовать
активность Са2+ - зависимой нейтральной протеазы в мозгу, печени, сердечной
мышце и сыворотке крови крыс при гипотермии разной глубины и длительности.
Исследовать
активность глицилглицин-дипептидазы в мозгу и печени пробуждающихся и лишенных
зимней спячки сусликов.
Исследовать
температурную зависимость общей активности нейтральных протеаз в печени в
динамике зимней спячки и индуцированном пробуждении сусликов при температуре
тела 10, 20, 25, 30 и 37°С.
Основные
положения, выносимые на защиту:
У
контрольных крыс и у бодрствующих летом сусликов в зависимости от тканевой
локализации (мозг, печень, сердце) наблюдается различие общей и Са2+-зависимой
активности нейтральных протеаз.
В
динамике зимней спячки сусликов суммарная (общая) активность нейтральных
протеаз претерпевает значительные колебания, специфичные для разных тканей.
На
этапах самосогревания сусликов, после индуцированного пробуждения общая
активность нейтральных протеаз не зависит от температуры тела, особенно, при
20, 25 и 30ºС.
Активность
глицилглицин-дипептидазы в тканях пробуждающихся и лишенных зимней спячки
сусликов отличается.
У
крыс по мере снижения температуры тела наблюдается падение активности
нейтральных протеаз. Пролонгирование глубокой гипотермии 20°С в течение 2 часов
приводит к повышению активности исследуемых ферментов по сравнению с данными
при 20°С.
Научная
новизна. В настоящей работе впервые в сравнительном аспекте исследована
активность нейтральных протеаз при искусственной и естественной гипотермии у
гомойотермных и гетеротермных животных. Выявлены органно-тканевые особенности
изменения нейтральных протеаз при исследуемых состояниях животных.
Новыми
являются данные об изменении общей активности нейтральных протеаз в динамике
зимней спячки и индуцированного пробуждения после 2-х месячной зимней спячки
сусликов.
Вперые
исследована активность глицилглицин-дипептидазы в тканях пробуждающихся и
лишенных зимней спячки сусликов.
Теоретическая
и практическая значимость. Изучение метаболизма при искусственном и
естественном охлаждении организма в сравнительном аспекте может приблизить нас
к пониманию общих механизмов резистентности гомойотермных животных к низкой
температуре тела, а также для понимания механизмов формирования патогенеза
холодового повреждения. Решение указанных теоретических проблем, может иметь
большое практическое значение при использовании метода гипотермии в медицинской
практике. Материалы, полученные при выполнении данной диссертационной работы,
используются при чтении курса «Энзимология», спецкурса «Кинетика ферментативных
реакций», в учебном процессе и на практических занятиях студентов по биохимии
ДГУ и филиала ЮФУ в г. Махачкале, в НИР.
Апробация
работы. Материалы диссертации докладывались на XII международной конференции
студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), на X
Республиканской научно-практической конференции (Махачкала, 2005), на
Международной научной конференции (Махачкала, 2006), на 10-й Пущинской
конференции молодых ученых (Пущино, 2006), на V-й Международной научно-практической
конференции (Тамбов, 2007), на совместном заседании кафедры биохимии и
биофизики с НИИ биологии ДГУ (3 февраля 2009, протокол №7), на заседании
кафедры биохимии и микробиологии Южного Федерального университета (21 марта
2009).
Публикации.
По данной диссертационной работе опубликовано 7 работ, в том числе две в
рекомендуемых ВАК журналах.
белок протеаза гипотермия спячка
ГЛАВА
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
TimeBiology