Структура и функции нейтральных протеаз

Установлено, что связывание глутаминовой кислоты со специфическими рецепторами плазматических мембран клеток гиппокампа крыс значительно увеличивается в присутствии кальция, и вероятно, также обусловлено действием кальпаина на эти рецепторы. Оно сопровождается расщеплением фодрина - спектринподобного белка, локализованного на внутренней поверхности плазматических мембран нервных клеток, и таким образом регулируется пластичность мембран (Сологуб, Пашковская, 1998).

Наиболее охарактеризованными членами семейства являются m-кальпаин и µ-кальпаин (соответственно, кальпаин II и I). Микромолярные концентрации Са2+ активируют m-кальпаин, а для активации µ-кальпаина требуются миллимолярные концентрации Са2+. Обе изоформы фермента являются гетеродимерами, состоят из большой каталитической 70-80 кДа субъединицы и малой, общей для обоих белков, регуляторной 29-30 кДа субъединицы. Большая субъединица содержит 4 домена (dI-dIV), а малая 2 домена (dV dVI) (Darrel et al., 2003).

Домен I действительно не является доменом, и представляет собой единственную α - спираль, состоящую из 10 аминокислотных остатков, которая заякоривается в полость dVI. Эта спираль очень важна для стабилизации и активации некоторых кальпаинов.

Домен II содержит в себе каталитическую сторону и может быть разделен на 2 субдомена - dIIa и dIIb (Khorchid, Ikura, 2002). Домен содержит остаток Cys в положении 115 (для µ- кальпаина) или 105 (для m - кальпаина), остаток His в положении 272 или 262, остаток Asn в положении 296 или 286. Эти аминокислотные остатки образуют каталитическую триаду, характерную для цистеиновых протеиназ таких как кальпаин или катепсины B, L и S. Замечено, что активная сторона Cys расположена в dIIa, в то время как His и Asn, которые образовывают остаток каталитической триады - в субдомене IIb. Каждый из субдоменов связывает по одному атому Са2+ в пептидной петле, состоящей из 8 (домен IIa) или 9 (домен IIb) аминокислотных остатков. Гомологичная последовательность домена II среди различных видов высока (85-93%) (Moldоveanu et al., 2002).

Домен III имеет последовательность, не гомологичную другим полипептидным последовательностям. В связывании Са2+- связывающих доменов молекулы кальпаина с каталитическим доменом II, участвует домен III, связывая фосфолипиды и участвуя в электростатическом взаимодействии (Hosfield et al., 2001). Анализ аминокислотной последовательности показал, что этот домен также содержит 2 потенциальные Са2+ - связывающие последовательности EF-руки, одна из некоторых находится между доменами II/III (остатки 329-341 для µ-кальпаина; остатки 318-338 для m-кальпаина; в домене IIb кристаллографической структуры m-кальпаина), а другая последовательность находится на границе III/IV доменов (остатки 554-565 для µ-кальпаина; 541-552 для m-кальпаина; в домене IV кристаллографической структуры m-кальпаина). Последовательность на границе II/III доменов не имеет конформацию EF-руки в кристаллографической структуре m-кальпаина крысы и человека и этот регион, возможно, не связывает Са2+ (Strobl et al., 2000). Таким образом, домен III состоит из 8 нитей по типологии схож с С-2 доменом, обнаруженным у различных белков, включая протеинкиназу С и фосфолипазу С, который взаимодействует с Са2+ и фосфолипидами. Кислая петля внутри домена III предположительно играет роль Са2+- способствующей активации кальпаина (Khorchid, Ikura, 2002).

Домены dIV и dVI являются хорошо охарактеризованными Са2+-связывающими доменами, каждый из которых содержит 5 мотивов EF-руки. Пятые мотивы этих доменов взаимодействуют между собой, образуя гетеродимер. Каждый мотив EF-руки схож с таковым мотивом в кальмодулине (24-44% идентичности у µ - кальпаина и 51-54% у m - кальпаина). Кальпаины представляют собой семейство пента-EF-рук, т.е. содержащие 5 мотивов EF-руки и они уникальны не только тем, что содержат определенное количество Са2+ - связывающих мотивов, но также и тем, что первичная последовательность отличается от таковой у кальмодулина.