Экспериментальная часть

Пересев - это перенос выращенной культуры микроорганизмов на питательной среде на другую свежую питательную среду.

Посев (и пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении определенных правил стерильности, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов.

Посев (или пересев) всегда проводят вблизи горелки. Пробирки при взятии мазка необходимо удерживать в наклонном положении, чтобы гарантировать стерильность культуры. Если их держать вертикально, то возможно попадание посторонних клеток микроорганизмов.

В пламени горелки тщательно обжигают бактериологическую петлю, держа ее в правой руке в отвесном положении. Мизинцем правой руки вынимают из второй пробирки ватную пробку и зажимают ее между мизинцем и ладонью, пробку первой пробирки зажимают между безымянным и средним пальцами правой руки. Снова слегка обжигают иглу и вводят ее в пробирку с культурой. Платиновая игла остывает очень быстро. Легким прикосновением ее к колонии микроорганизмов берут небольшое количество микробной массы и переносят во вторую пробирку.

Окраска клеток микроорганизмов по Граму. Метод дифференциации микробных клеток, основанный на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем, у других видов это соединение временно появляется временно и после обработки спиртом растворяется. Микробы первой группы называются грамположительными, второй - грамотрицательными.

Техника окраски по Граму. На хорошо обезжиренное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них - контрольные с заведомо известным отношением к окраске по Граму). Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1мин феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держа стекло в несколько наклоненном положении. Препарат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачивая ,96% -ным спиртом в течение 15-20 с. Время обесцвечивания очень существенно, при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки, при недостаточном сроке обработки препарат окажется перекрашенным.

Промыв препарат водой, его окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1мин. После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно - фиолетовый цвет, грамотрицательные имеют только цвет дополнительной окраски.

Выделение каталазы. Проводят на предметном стекле в капле 5% перекиси водорода. Стерильной бактериологической петлей вносят исследуемую культуру и тщательно перемешивают. При наличии каталазы происходит разложение перекиси водорода с выделением пузырьков кислорода.

Проба на аммиак. Выделяющийся в атмосферу аммиак окрашивает подвешенную влажную красную лакмусовую бумагу в синий цвет. Накопления аммиака в среде устанавливают при помощи реактива Несслера. На предметное стекло наносят каплю исследуемой культуральной жидкости и вносят каплю реактива Несслера. При большом количестве аммиака образуется коричневый или буроватый осадок, при небольшом - появляется оранжевая или желтая окраска.

Проба на сероводород. Полоску фильтров бумаги пропитывают раствором уксуснокислого свинца, высушивают и помещают в пробирку, укрепив ватной пробкой. В присутствии сероводорода полоска бумаги через несколько дней чернеет. Образование на поверхности почерневшей бумаги серебристого налета свидетельствуют о выделении и других соединений среды (меркаптанов). При введении в состав питательной среды лимоннокислого или виннокислого железа выделение сероводорода ведет к почернению всей среды. Поверхностный посев. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15 - 20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушить для удаления конденсационной воды, например, поместив чашки в термостат на 2-3 суток крышками вниз. В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную поверхность проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2 - 4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпателем. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз. Среды Гисса (Пестрый ряд). Гисс - разновидность дифференциальных сред, предназначенных для изучения сахаролитических свойств микроорганизмов. Состав: пептонная вода или бульон, углевод (сахар или многоатомный спирт), индикатор рН. В пробирки с глюкозой помещают "поплавок", что позволяет определить глубину расщепления: - кислота, КГ - кислота и газ. В качестве основы может использоваться полужидкий агар.