Методы определения оксида азота

Наиболее чувствительным среди методов определения NO в организме или в клеточных системах является электрохимический метод. Он основан на каталитическом окислении оксида азота полимерным металлопорфирином (полупроводником n-типа), которое протекает при 630 мВ. Диаметр электрода может достигать 0,2 мкм, что позволяет измерять внутриклеточное производство оксида азота. Поскольку время ответа электрода составляет около 10 мс, часть радикалов, вступающая в очень быстрые реакции (например, с супероксид-радикалом), не может быть зарегистрирована [15]. С помощью этого методы были проведены измерения содержания оксида азота в крови человека [1].

Хемилюминесцентный метод основан на регистрации фотонов, излучаемых в реакции NO с озоном. Несмотря на высокую чувствительность, применение его к биологическим объектам затрудняется сложным этапом доставки радикала в анаэробную газовую фазу. Кроме того, на выход люминесценции оказывают влияние аммиак, олефины, окислы серы и другие продукты, выделяющиеся в результате биологической активности организма и часто содержащиеся в стенках аппаратуры [1].

Среди непрямых

методов определения NO (таблица 3) наиболее распространенным методом оценки его синтеза является реакция на нитрит-анион с использованием реагента Грисса (раствор сульфаниламида и N-(1-нафтил) -этилендиамида в 2,5%-ной ортофосфорной кислоте), которая дает окрашенный дазопродукт с максимумом поглощения при 548 нм. Обычно отношение содержания NO-2/NO-3 у млекопитающих составляет 1 : 10. и хотя содержание нитрит-аниона менее подвержено влиянию состава питания, при необходимости более полного определения продукции оксида азота измеряют и содержание нитрат-аниона. Для этого NO-3, выделяющийся в культурную среду или биологические жидкости, восстанавливают металлическим кадмием, импрегнированным медью, или ферментативно, нитратредуктазой [1].

Таблица 4. косвенные методы определения оксида азота [1].

Соединение-индикатор	Принцип определения	Метод регистрации, чувствительность
Метгемоглобин	Hb-Fe(II)-O2 + NO = =Hb-Fe(III) + NO-2	Фотометрия, 2 нм
Иминонитроксид (ИН)	Нитронил нитроксид+NO = =ИН	ЭПР
Нитрит-анион	NO-2 + реагент Грисса = диазопродукт	Фотометрия, 1 мкм
Нитрит-анион	ФТИО* + NO = NO-2	То же
Нитрат-анион	NO-3 + Cd = NO-2 NO-3 + нитратредуктаза = =NO-2	То же
Нитрит-анион	NO-2 + S2O-4 = NO+Hb-Fe(II) = Hb-Fe(II)-NO	ЭПР, 1 мкм
Цитруллин	3H-L-аргинин + NOc = 3H-L-цитруллин	ВРЖХ, радиометрия; 0,1 мкм
цГМФ	NO + 3Н-ГМФ + ГЦ = =3Н-цГМФ	Хроматграфия, радиометрия
бис-Формазан (БФ)	ТНС* + NOc + НАДФ.Н = =БФ	Гистохимия
НАДФ.Н	НАДФ.Н + L-аргинин + NOc = НАДФ.Н	Флуорометрия

*ФТИО - 2-(4-карбокифенил)-4,4,5,5-тетраметилимидазолин-3-оксид-1-оксил;

ТНС - тетразолий нитросиний;

ГЦ - гуанилатциклаза.

Высокую чувствительность имеет метод, основанный на фотометрии метгемоглобина, образующегося в результате окисления оксигемоглобина NO. Применения двухволновой спектрофотомерии дает возможность определять до 2 нМ оксида азота [9]. В качестве субстратов также могут быть использованы дезокси- и карбоксигемоглобин. Серьезным недостатком, ограничивающим применение этих методик, является необходимость очистки исследуемых объектов от эндогенного гемоглобина, а также соединений, способных его окислять[1].