Биоорганическая химия

Задание № 3

Ферменты. Химическая природа и общие принципы обнаружения активности ферментов. Перечислите четыре фактора, обуславливающие каталитическую силу ферментов. Ответить на вопрос: перенос протона от фермента на субстрат - нередко ключевой этап катализа.

А. Имеет ли место этот этап при катализе химотрипсином, лизоцимом и карбоксипептидазой А?

Б. Если да, то определите донор водорода в каждом случае.

Ферменты могут иметь все четыре уровня структурной организации: первичную, вторичную, третичную и четвертичную. Большинство ферментов имеют четвертичную структуру.

По химической природе фермент могут быть белками простыми (ферменты протеины) и сложными (ферменты протеиды).

Каталитическая функция ферментов определяется наличием одного или нескольких активных центров.

Активный центр - это участок в пространственного структуре фермента, с которым связывается субстрат и подвергается химическому превращению. Число активных центров может быть равно числу субъединиц в четвертичной структуре фермента, т.е. сколько субъединиц (протомеров), столько активных центров.

В активном центре условно выделяют два участка:

контактный (якорный или субстратный), отвечающий за специфичность связывания субстрата (узнавание);

каталитический, где происходит химическое превращение субстрата после его связывание (сначала фермент узнает субстрат, притягивает его, затем субстрат располагается в этом активном центре.

Структурная организация фермента.

. Особенности образования активного центра у ферментов протеинов (простых белковых ферментов).

Обычно он образован 12-16 аминокислотными остатками полипептидной цепи. Иногда их число больше. Аминокислоты, формирующие активный центр, находятся в разных местах полипептидной цепи. При пространственной укладки белка-фермента (в третичную структуру), они сближаются и образуют активный центра.

Приблизительно 1/2 - 1/3 аминокислот фермента прямо или косвенно участвуют в работе активного центра.

. Особенности образования активного центра у ферментов-протеидов (сложных белков-ферментов).

Протеиды состоят из:

Апофермент (белковая часть) + кофактор (небелковая часть) = холофермент (активный комплекс).

Кофактор (или простетическая группа) чаще всего предствавлен витаминами или ионами металлов.

Холофермент в диссоциированном состоянии неактивен.

У ферментов-протеидов главную роль в катализе играют кофакторы, а боковые радикалы аминокислот и их функциональные группы в апоферменте отвечают за специфичность связывания с субстратом и регуляторами (активаторами и ингибиторами) Таким образом, якорный участок активного центра и регуляторные центры находятся в апоферменте.

Кинетика ферментативных реакций - этот раздел энзимологии изучает зависимость скорости ферментативной реакции от условий взаимодействий субстрата с ферментом (в том числе от факторов среды). Основы были заложены в работах Михаэлиса и Ментен.

Скорость ферментативной реакции определяется количеством вещества (субстрата), которое превращается в единицу времени.

Скорость является мерой способности фермента катализировать реакцию и обозначается как активность фермента.

Измерить активность фермента можно только косвенно: по концентрации превращаемого субстрата или нарастанию концентрации продукта в единицу времени.

Скорость ферментативной реакции зависит от:

. концентрации субстрата;

. концентрации фермента;

. реакции характера рН-среды;

. температуры

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.

В определенном ограниченном интервале температур скорость ферментативной реакции увеличивается с ростом температуры. Повышение скорости реакции по мере приближения к оптимальной температуре (от 0 до 40 °С) объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул. При дальнейшем увеличении температуры кинетическая энергия молекулы фермента становиться достаточной для разрыва связей, поддерживающих вторичную, третичную и четвертичную структуру фермента в нативном состоянии. Это приводит к тепловой денатурации фермента.

При низкой температуре происходит обратимая инактивация фермента, т.к. наблюдаются незначительные изменения конформации активного центра фермента.

Фермент имеет белковую природу, поэтому температура на него, влияет также как на белок (повышении температуры приводит к денатурации).

Задание № 4

Виды иммобилизации ферментов (не менее трех препаратов), принципы иммобилизации, практическое применение данных препаратов.

Иммобилизованные ферменты, препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняя при этом полностью или частично свои каталитические свойства. Иммобилизованные ферменты обычно не растворимы в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитич. р-ции, ингибиторов и активаторов. Существует неск. осн. способов иммобилизации ферментов: 1) путем образования ковалентных связей между ферментом и матрицей; 2) полимеризацией мономера, образующего матрицу, в присут. фермента, к-рый при этом оказывается включенным в сетку полимера - обычно геля; 3) благодаря электростатич. взаимод. противоположно заряженных групп фермента и матрицы; 4) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу; 5) связыванием фермента и матрицы в результате невалентных взаимод. - гидрофобных, с образованием водородных связей и др.; 6) инкапсулированием - созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, напр., включением фермента в липосомы; 7) сшиванием молекул фермента между собой, напр., глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой к-ты. Особый случай иммобилизации проведение ферментативных р-ций в двухфазной системе, когда фермент находится в водной фазе, а субстраты и продукты р-ции распределяются между орг. и водной фазами, что позволяет в зависимости от коэф. распределения в-в между фазами сдвигать равновесие р-ции в нужную сторону; диспергирование фаз увеличивает пов-сть их раздела и тем самым улучшает доступ субстрата к ферменту. Среди способов иммобилизации наиб. распространение получили ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель. В первом случае в качестве матрицы обычно используют целлюлозу, декстрановые гели (сефароэу, агарозу), микропористые стекла или кремнеземы, а также синтетич. полимеры. Матрицу при ковалентной иммобилизации ферментов обычно предварительно активируют, обрабатывая, напр., бромцианом, азотистой к-той или цианурхлоридом. Благодаря этому она становится носителем активных группировок, к-рые способны вступать в р-цию сочетания, взаимод. с группами NH2, ОН, СООН. Во втором случае в качестве гелеобразующего полимера используют полиакриламид. На практике иммобилизация часто осуществляется одновременно неск. способами. Так, при фиксации ферментов ковалентными связями между их молекулами и матрицей обычно возникают также нековалентные взаимодействия. Известны способы предварит. хим. модификации молекул фермента низкомол. в-вами или р-римыми полимерами, имеющими заряженные группировки, что изменяет у таких модифицир. белков электростатич. заряд молекулы и позволяет достаточно прочно сорбировать их на ионообменных смолах. При всех типах иммобилизации матрица, взаимодействуя с ферментом, может инактивировать последний или создавать пространств. затруднения для доступа субстрата к активному центру. При ковалентном связывании фермента для предотвращения отрицат. влияния матрицы между ней и молекулой фермента вводят разобщающую цепь атомов - спейсер (наз. также «вставкой» или «ножкой»). Кроме того, часто стремятся использовать для иммобилизации гидрофильные матрицы, создающие вблизи фермента более естеств. микроокружение. При иммобилизации ферментов необходимо, чтобы активные группы матрицы не блокировали каталитич. центр фермента, а условия иммобилизации не приводили к потере его активности. Определенные ограничения на способ иммобилизации налагают и особенности субстрата. Так, в случае высокомол. субстратов нельзя использовать методы инкапсулирования или включения фермента в гель. Если матрица несет на себе заряды, то заряд субстрата влияет на кинетич. параметры р-ции: разноименные заряды на носителе и субстрате увеличивают скорость р-ции, катализируемой иммобилизованными ферментами, одноименные заряды ее снижают и м. б. причиной полной потери активности препарата. Заряды носителя и субстрата влияют также на величину рН, при к-рой скорость ферментативной р-ции максимальна. Важную роль играет распределение субстрата между фазами иммобилизованного фермента и р-ра. Ограниченная доступность субстрата к активному центру фермента может привести к изменению специфичности последнего. Особенно это Характерно для высокомол. субстратов, к-рые из-за малого коэф. диффузии медленно переходят в фазу иммобилизованного фермента, что приводит к относит. увеличению скоростей др. р-ций с участием субстратов меньших размеров. В нек-рых случаях возможно также изменение направления р-ции. Так, фермент эндополигалактуроназа, катализирующий расщепление полигалактуроновой к-ты в середине молекулы, после иммобилизации отщепляет низкомол. фрагменты от концов молекулы. Существ. влияние на кинетику р-ций, катализируемых иммобилизованными ферменами, оказывают два диффузионных барьера - внешний и внутренний. Первый обусловлен наличием тонкого неперемешиваемого слоя р-рителя вокруг частицы иммобилизованного фермента (слоя Нернста). Толщина этого слоя зависит от скорости перемешивания. Поэтому увеличение последней или скорости тока р-ра в колонке с иммобилизованным ферментом увеличивает скорость ферментативной р-ции. Внутр. диффузионный барьер возникает вследствие ограничения своб. диффузии субстрата внутри сетки полимерной матрицы. Иммобилизация ферментов создает ряд преимуществ. К ним относятся: более высокая стабильность ферментных препаратов, возможность их удаления из реакц. среды и его повторного использования, а также возможность создания непрерывных процессов на ферментных колонках. Важное значение имеет относит. стабильность иммобилизованных ферментов к денатурирующим воздействиям - нагреванию, действию агрессивных сред, автолизу и др. Последнему подвержены протеолитич. ферменты. Иммобилизация разобщает молекулы этих ферментов и полностью исключает такой процесс. Благодаря этому удалось изучить механизм образования протеолитич. фермента пепсина из его предшественника пепсиногена (при этом от последнего отщепляется пептид, состоящий из 42 аминокислотных остатков). Было показано, что эта р-ция катализируется самим пепсином. Иммобилизованные ферменты применяют в произ-ве L-аминокислот, 6-аминопенициллановой к-ты, из к-рой получают полусинтетич. пенициллины, в синтезе преднизолона, для удаления лактозы из продуктов питания, используемых больными с лактазной недостаточностью, в изготовлении ферментных электродов для экспресс-определения мочевины, глюкозы и др. в-в, для создания аппаратов «искусств. почка» и «искусств. печень», для удаления эндотоксинов, образующихся в процессе заживления ран и ожогов, при лечении нек-рых онкологии, заболеваний и др. Большое значение приобрели в клинич. и лаб. практике иммуноферментные методы анализа, в к-рых также используются иммобилизованные ферменты.