Частные примеры применения многофакторного поиска

При просмотре в электронном микроскопе (негативный контраст, фиксация фосфорно-вольфрамовой кислотой) наблюдали классические фимбрии, в отличие от клеток, выращенных на среде Минка. Повышение качества агглютинации до уровня (4+) было затруднено нестабильностью экспрессии признака F41 при выращивании продуцента на разработанной среде. Клонирование признака F41 не привело к получению более стабильного и активного продуцента. Полученные результаты были признаны патентоспособными /8/.

Поскольку ВП измеряли с высокой ошибкой из-за отсутствия более точных методов, то полученные результаты не столько служили для количественных расчетов, сколько способствовали экспериментальному нахождению области, близкой к оптимальной. Такой подход легко оспорить и трудно обосновать, но в данном случае он сработал.

Применение убитой культуры для инъекций кроликов повышает выход животных, выдержавших курс гипериммунизации (1,5 месяца). При инактивации культуры происходит частичная инактивация антигенов, поэтому такую процедуру можно проводить только с клетками, которые содержат много нужного антигена в своем составе.

В дальнейшем была сконструирована плотная питательная среда на основе пептона (7 -12 -г/л) с лактозой (2 - .4 - г/л) при рН 8,0. Количество добавляемого фосфата (3 -10 г/л) зависит от партии пептона и содержания в нем неорганического фосфата. Замена глюкозы на лактозу повышает как селективность среды для роста лактозоположительных кишечных палочек, так и технологичность, т.к. лактоза не образует токсичных соединений с азотсодержащими компонентами при автоклавировании в составе готовой среды в режимах до 1 атм., 30 мин.

При наличии хорошей партии пептона, не обсемененной спорообразующими микробами, достаточно прокипятить 5-10 мин. готовую среду и сразу использовать. Даже в случае низкой обсемененности достаточно прокипятить готовую среду дважды в течение дня. Это весьма практично при работе с быстрорастущими штаммами, не подлежащими длительному хранению и дальнейшему использованию после измерения нужных биохимических или иммунохимических свойств.

Полученные в дальнейшем результаты с использованием разработанной среды и наличии высокотитражной специфичной антисыворотки /8,20/ свидетельствуют, что отсутствие в среде углеводов полностью выключает синтез антигена F41. Такие клетки можно использовать при фракционирования поливалентной сыворотки для удаления посторонних антигенов в качестве афинного сорбента. Наличие эритрита тоже отрицательно влияет на синтез антигена. Маннит, сорбит, ксилоза, мальтоза влияют на синтез антигена F41 положительно. Другие углеводы, сахароспирты и жирные кислоты не испытывали. Добавление глицерина приводит к образованию обильного внеклеточного полисахарида, значительно затрудняющего суспендирование бакмассы в физрастворе до смешивания с антисывороткой.

Описанная выше среда на основе пептона и лактозы обеспечивает синтез антигена F41 при глубинном культивировании, но работа в этом направлении не была завершена, среда нигде не описана ранее. При применении различных источников углерода в составе разработанной среды, возможно, наблюдать штаммоспецифичное разнообразие экспрессии антигена, что происходит при эпизоотологическом анализе распространения антигена F41 среди изолятов кишечной палочки, выделенных из неблагополучных по колидиарреи хозяйств. Эту работу проводили на базе бывшей фирмы “Диавак'' под руководством Гусева В.В. и при помощи Тазиной О.И. и Глазкова Н.К.

Вид клеток кишечной палочки ВГНКИ 397А /37-14, выращенных на разработанной среде /8,20/. Фимбрии представлены в большом количестве и достаточно наглядно. Белая черта на фото - 1 мкм. Для фото выбрана одна из лучших клеток, поскольку разброс в количестве фимбрий на клетку в популяции весьма велик.

Описанный подход многофакторного поиска был использован при изучении влияния условий культивирования на антигенный состав вакцины чумного микроба /12/. Приводимые здесь детали планирования ОЭ и обработки ПФЭ не были опубликованы ранее в силу специфики журнала /12/ и опубликованы позже /14,20/. Постановка ПФЭ 24 для изучения вакцины чумного микроба позволила в первой же серии из 16 экспериментов найти условия, при которых пестицин и F - антиген экспрессировались независимо при разных условиях культивирования, что согласуется с опубликованными ранее данными генетиков о том, что эти антигены находятся в составе разных оперонов и регулируются независимыми промоторно - операторными участками. В сериях однофакторных экспериментов получить такую информацию было бы крайне затруднительно. А генетикам необходимо располагать данными физиологов, чтобы строить модели регуляции экспрессии того или иного признака конкретным продуцентом.