Инкубационная смесь содержала 0.4 мл 0.005М раствора глицил-глицина в фосфатном буфере рН 7.6 и 0.4 мл гомогената с 0.001М хлористым кобальтом. Инкубацию проб тканей проводили в ультротермостате при 37ºС и 10ºС в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 0.4 мл 5% раствора ТХУ. В контрольные пробы ТХУ добавляли перед внесением субстрата.
Пробы центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. В надосадочной жидкости определяли прирост глицина нингидриновым методом.
Цветная реакция
В пробирку отбирали 0.4 мл фильтрата, добавляли 1 мл нингидринового реактива, тщательно перемешивали стеклянной палочкой для получения однородной смеси. Далее пробу помещали на 12 минут (точно!) в кипящую баню и после этого охлаждали холодной водой.
Интенсивность окраски измеряли на КФК-2 при 570 нм против контрольных проб.
Активность фермента выражали в мкмоль глицина, освободивщегося при гидролизе глицилглицина за 30 минут инкубации при 37ºС и 10ºС (рН 7.6) в расчете на 100 мг ткани и на мг белка.
Приготовление реактивов. 0,05М фосфатный буфер рН 7.6
.2М раствор фосфата калия -5мл
.2М раствор гидроокиси калия -4.24мл
довести водой до 20мл и определить рН -7.6
. 0,5 М цитратный буфер рН -5.5
.5М раствор лимонной кислоты -5.1 мл
.5 М раствор цитрата натрия -14.9мл
. 0,001 М СоСl2 *6Н2О (М.м =238г)
Взвесить 23.8 мг -СоСl2* 6Н2О и добавить в 100 мл 0.25М раствора сахарозы.
. Нингидриновый реактив (готовить непосредственно перед цветной реакцией)
мг нингидрина взвесить на торсионных весах и растворить в 12 мл 0.5М раствора цитратного буфера рН 5.5 при подогревании на водяной бане (400С). Раствор охладить и к нему добавить 24мл глицерина. Реактив тщательно перемешать.
. 0.25М раствор сахарозы. 8.55г сахарозы перенести в колбу на 100мл и растворить в небольшом количестве воды и затем довести до 100мл.
TimeBiology