Метод центрифугирования почвенной суспензии

Для выделения актиномицетов из почв и особенно из почв в весеннее время, когда в ней развивается большое число грибов и бактерий, применяетсяметод центрифугирования почвенной взвеси. Метод основан на различии скорости оседания отдельных видов микроорганизмов в центробежном поле. При 3000 об/мин в течение 20 мин частицы, соответствующие по размерам спорам плесеней или клеткам бактерий осаждаются на дно пробирки. Частицы же, соответствующие по размерам спорам актиномицетов, оказываются при данной скорости центрифугирования в поверхностном слое жидкости.

Высевая надосадочную жидкость, удается в большинстве случаев (до 92%) получить на пластинках питательного агара только колонии актиномицетов.

5. Метод замораживания - оттаивания почвы

Известно, что микроорганизмы в почве находятся в адсорбированном на почвенных частицах состоянии. Для полноты десорбции микроорганизмов с почвенных частиц применяются различные методы: химические, при которых почвенные образцы обрабатывают различными детергентами, физические, в основе которых лежит метод механического растирания образцов почвы.

Для лучшей десорбции микроорганизмов с почвенных частиц рекомендуется использовать метод замораживания - оттаиванияпочвы. Суть метода состоит в следующем. Отобранный для выделения актиномицетов образец почвы помещается в испаритель бытового холодильника при температуре 8°. Через час образец извлекается из холодильника и выдерживается при комнатной температуре до полного оттаивания. Процедуру замораживания-оттаивания повторяют дважды. Затем навеску почвы помещают в стерильную водопроводную воду, взбалтывают суспензию в течение 15 мин на круговой качалке при 230 об/мин, после чего различные разведения суспензии высевают на питательную агаровую пластинку в чашках Петри.

Метод замораживания - оттаивания образцов почвы позволяет обнаружить в них в 1,2-3,6 раза больше актиномицетов, чем в тех же образцах без замораживания. Это, по-видимому, связано с повышением десорбции актиномицетов с поверхности почвенных частиц.

Очистка антибиотика производится хроматографическими методами (хроматография на оксиде алюминия, целлюлозе, ионитах) или противоточной экстракцией. Очищенные антибиотики подвергают лиофильной сушке.

После выделения антибиотика проводят испытания его чистоты. Для этого определяют его элементный состав, физико-химические константы (температуру плавления, молекулярную массу, адсорбцию в видимой, УФ- и ИК-областях спектра, удельное вращение). Исследуют также антибактериальную активность, стерильность и токсичность антибиотика.

Токсичность антибиотиков определяют на экспериментальных животных, которым в течение определенного периода внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или иным путем вводят различные дозы изучаемого антибиотика. При отсутствии внешних изменений в поведении животных в течение 12-15 сут считают, что испытуемый антибиотик не обладает заметными токсическими свойствами. При более глубоком исследовании выясняют, обладает ли данный антибиотик скрытой токсичностью и влияет ли на отдельные ткани и органы животных.

Одновременно исследуют характер биологического действия антибиотика - бактериостатический или бактерицидный, что позволяет прогнозировать механизмы его антибактериальных свойств.

Следующий этап изучения антибиотика - оценка его терапевтических свойств. Экспериментальных животных заражают определенным видом патогенного микроба. Минимальное количество антибиотика, предохраняющее животного от смертельной дозы инфекции, является минимальной терапевтической дозой. Чем больше отношение токсичной дозы антибиотика к терапевтической, тем выше терапевтический индекс. Если терапевтическая доза равна токсической или приближается к ней (низкий терапевтический индекс), то вероятность применения антибиотика в лечебной практике ограничена или совсем невозможна.

В том случае, когда антибиотик входит в широкую медицинскую практику, разрабатывают промышленные методы его получения и детально изучают его химическую структуру.

Стандартизация антибиотиков. За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, способное подавить развитие или задержать рост стандартного штамма тест-микроба в определенном объеме питательной среды. Величину биологической активности антибиотиков выражают обычно в условных единицах дозы (ЕД), содержащихся в 1 мл раствора (ЕД/мл) или в 1 мг препарата (ЕД/мг). Например, за единицу антибиотической активности пенициллина принято считать минимальное количество препарата, способное задерживать рост золотистого стафилоккока стандартного штамма 209 в 50 мл питательного бульона. Для стрептомицина за единицу активности принято считать минимальное количество антибиотика, задерживающее рост Е. coli в 1 мл питательного бульона.